熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒實驗操作

　　Annexin V是鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，其對磷脂酰絲氨酸PS具有高親和力。在細胞凋亡的早期，它通過細胞外暴露的PS與細胞膜結合，并使用流式細胞儀用熒光染料標記AnnexinV。熒光顯微鏡可以檢測細胞凋亡。由于緩慢的凋亡或壞死細胞膜完整性的喪失，核染色劑可進入細胞并染色核。 當與膜聯蛋白A結合使用時，它可以區分處于凋亡不同階段的細胞。

　　1.懸浮細胞：

　　A.根據實驗方案誘導細胞凋亡，以300 g離心5分鐘，棄去上清液，收集細胞，用PBS洗滌一次，然后輕輕重懸并計數細胞。

　　B.取1-5 x 105重懸細胞，以300 g離心5分鐘，棄去上清液。 通過添加500μL稀釋至1×的膜聯蛋白V結合緩沖液重懸細胞。

　　C.向細胞懸液中加入5μL熒光素標記的膜聯蛋白V和5μL核染色劑。

　　D.輕輕渦旋并混合，然后在室溫下于黑暗中孵育15-20分鐘。

　　E.反應完成后，將立即對機器進行測試。如果測試不及時，請將其放在冰上，避免光照，以在1小時內完成測試。

　　F.檢測

　　1)流式細胞儀檢測

　　處理好的樣本在流式細胞儀上檢測。

　　2) 熒光顯微鏡分析

　　取一滴用熒光素-Annexin V/細胞核染色液雙染的細胞懸液(E步驟處理過的細胞懸液)于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。

　　2.貼壁細胞

　　1)流式細胞儀檢測

　　A.根據實驗方案誘導細胞凋亡，吸出培養基，轉移到干凈的離心管(備用)中，并用PBS洗滌培養瓶中的細胞。

　　B.將適量的胰蛋白酶消化的細胞添加到培養瓶中，并在室溫下孵育，直到通過輕輕移液將附著的細胞分離，并吸出胰蛋白酶消化的溶液，以避免胰蛋白酶過度消化。注意：對于貼壁細胞，胰蛋白酶消化步驟很重要。如果胰蛋白酶的消化時間太短，則需要吹走細胞并容易損壞細胞膜，從而導致細胞壞死的假陽性。如果消化時間過長，很可能會發生。它會導致細胞膜受損，細胞壞死的假陽性，并影響磷脂酰絲氨酸與細胞膜上膜聯蛋白V-熒光素的結合，從而干擾細胞凋亡的檢測。同時，胰蛋白酶細胞消化應不含EDTA，因為EDTA會影響膜聯蛋白V與磷脂酰絲氨酸的結合。

　　C.加入步驟A中收集的細胞培養基，輕輕吹動細胞，轉移到離心管中，以300 g離心5分鐘，棄去上清液，收集細胞，用PBS洗滌細胞一次，并輕輕懸浮細胞。注意：添加細胞培養基非常重要。另一方面，可以收集已經發生凋亡或壞死的漂浮細胞。另一方面，細胞培養物中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶(消化殘余的胰酶，然后添加膜聯蛋白V-熒光素以降解和染色失敗)。

　　D.取1-5 x 10重懸細胞，以300 g離心5分鐘，棄去上清液。通過添加500μL稀釋至1×的膜聯蛋白V結合緩沖液重懸細胞。

　　E.向細胞懸液中加入5μL熒光素標記的膜聯蛋白V和5μL核染色劑。

　　F.輕輕渦旋并混合，然后在黑暗中于室溫下孵育15-20分鐘。

　　G.反應完成后立即在機器上進行測試。如果測試不及時，請將其放在冰上，避免光照，以在1小時內完成測試。

　　H.流式細胞儀檢測

　　2)熒光顯微鏡原位檢測注：本方法優點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于貼壁不牢而檢測不到。

　　A.如果條件可以，在誘導凋亡后，用多孔板離心機300g離心5min。

　　B.吸除細胞培養液，用PBS洗滌兩次(如果條件允許，在此前做步驟A)。

　　C.離心后棄上清，加入500μL稀釋成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液。

　　D. 加入5μL的熒光素標記-Annexin V和5μL的細胞核染色液。

　　E.移液器輕輕混勻，室溫避光孵育15-20min。

　　F.Annexin V Binding Buffer工作液洗滌細胞一次

　　G. 熒光顯微鏡檢測。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。(如果無法觀察，可以在孔板下鋪上玻片使細胞貼附，然后取出用Annexin V Binding Buffer浸潤觀察)

　　H. 反應完成后應立即觀察，取出貼附細胞玻片時，避免細胞干片。