原代角質(zhì)形成細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

　　越來越多的原代細(xì)胞被用于相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗。人們不再單單趨于使用細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗研究，細(xì)胞系在體外長期培養(yǎng)后往往會失去其原有的生物學(xué)特性，對藥物處理的反應(yīng)差距越來越大。角質(zhì)形成細(xì)胞是不斷分化的分層鱗狀上皮細(xì)胞，分化的末尾階段是角蛋白的形成。根據(jù)角質(zhì)形成細(xì)胞的發(fā)育階段和特點(diǎn)，從內(nèi)到外可分為5層。基底細(xì)胞層又稱生發(fā)層，棘細(xì)胞層，顆粒層，透明層，角質(zhì)層。下面原代細(xì)胞廠家介紹一下原代角質(zhì)形成細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。

　　1. 將新鮮包皮組織裝入盛有無菌生理鹽水或 1 x PBS 的無菌容器中，置于培養(yǎng)箱中，6 小時內(nèi)置于冰上，運(yùn)送至實(shí)驗室進(jìn)行后續(xù)分離。

　　2、在無菌環(huán)境中取出包皮組織，用1×PBS清洗2-3次以去除表面的血液，并在75%酒精中浸泡100秒。

　　3. 將組織浸泡在酒精中后，迅速將組織轉(zhuǎn)移到含有 1 x PBS 的培養(yǎng)皿中，搖晃數(shù)次以洗滌以去除酒精，然后用眼科剪小心剪去皮下組織(脂肪，微血管等)

　　4、去除脂肪和毛細(xì)血管組織后，用1×PBS洗幾次，切成約3mm*8mm的皮片，14度消化液消化過夜(15-18小時)。

　　5. 第二天，使用兩把眼科鑷子，小心地撕開消化的皮膚組織過夜以分離表皮。

　　6.分離的表皮用眼科剪剪成小塊，337℃水浴消化1小時。

　　7. 消化完成后，用移液器完全吸取約 100 次，用含血清培養(yǎng)基完成消化。通過 200 目不銹鋼網(wǎng)篩后，取濾液懸浮液并轉(zhuǎn)移至 15 ml 離心管中。 400 g 離心 10 分鐘。完成后，丟棄上清液。通過用 3 ml 1 x PBS 移液器重懸沉淀，以 400 g 離心 5 分鐘，棄去上清液。用 2 ml 移液重懸沉淀后。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到原代角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移到含有2ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中，在37°C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　8. 48-72小時后根據(jù)細(xì)胞粘附情況更換培養(yǎng)基以去除非粘附細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞增殖狀態(tài)和培養(yǎng)基顏色每2-3天更換一次培養(yǎng)基..然后進(jìn)行常規(guī)傳代和增殖程序，直到細(xì)胞粘附達(dá)到 80-90%(角質(zhì)形成細(xì)胞對胰蛋白酶不太敏感，消化時間可以增加到 10-15 分鐘，如果根據(jù)已滅菌的細(xì)胞，您可能需要使用刮刀進(jìn)行傳代)。

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