基因敲除細胞系構建流程

　　生物學家總是在基因敲除細胞之前進行基因敲除，但由于shRNA本身的技術限制，無法獲得基因功能完全缺失的體細胞，shRNA敲除的情況頻頻發生，但體細胞WB的實際效果并不是很明顯好的。另外Knockout應用移碼敲除的方法也會出現WB敲除不干凈的難題!所以，畢竟我們選擇創造基因敲除細胞(大面積敲除)來徹底敲除基因基因的蛋白質功能。怎樣才可以效率高的做體細胞遺傳基因大面積段敲除呢?原代細胞公司的小編下面就來說明一下：

　　基因敲除細胞系的步驟以下：

　　1.選擇敲除基因位點和Cas9X敲除載體構建：(2周)

　　通常，您選擇 1-10 kb 的片段大小進行敲除。這個大小適合效率。選擇非三倍率外顯子進行敲除通常更有效。如果你對它滿意，你能夠挑選大的精彩片段做就可以了;

　　然后，您可以設計生成 Dual-gRNA 的計劃，根據 PCR 將目標 gRNA 整合到敲除培養基中，并在轉錄組測序后將其用于事后實驗。

　　2、體細胞的提前準備與轉染：(2周)

　　Cas9X一般應用電轉的方法搭建體細胞敲除細胞株：一般搭建敲除細胞株能夠 應用電轉或是病毒感染或是脂質體的轉染方法;

　　A、脂質體的參照每個企業的使用說明;

　　B、假如應用電轉的效率會高1倍上下;

　　C、應用Cas9X特有的VIRUS-Free技術性的高效率與應用病毒感染的實際效果基礎非常(可是周期時間減少一半);

　　電轉后歷經三天的藥物篩選，隨后就可以做單克隆了。

　　基因敲除細胞系全過程中單克隆的方式有三種，這三種方式原代細胞公司的小編下一次會給與表明解讀。