角質形成細胞分離的常用方法

　　原代細胞在相關細胞實驗使用過程中越來越多，人們不再單單趨于使用細胞系進行實驗研究，因為細胞系常常由于體外長期培養，而容易丟失原有的生物學特性，對藥物處理的反應差距越來越大。為了更好的服務于廣大科研工作者，我司技術人員特提供了角質形成細胞分離的常用方法。

　　1.新鮮的表皮組織，裝盛于含有無菌生理鹽水或1×PBS的無菌容器中，于保溫盒中，冰上放置離體6h內運輸到實驗室進行后續分離。

　　2.在無菌環境中取出表皮組織，用1×PBS清洗2-3次去除表面血液后，75%的酒精浸泡100s

　　3.酒精浸泡組織后快速將組織轉入裝有1×PBS的培養皿中震蕩清洗數次以去除酒精，然后用眼科剪小心剪去皮下組織(脂肪，微血管等)

　　4.將去除了脂肪和微血管組織的再用1×PBS清洗幾次后，剪成3mm*8mm左右的皮片，用消化液1 4度消化過夜(15-18h)。

　　5.第二天，用2個眼科鑷子小心撕開過夜消化的皮膚組織，分離和表皮;

　　6.分離的表皮用眼科剪剪碎后用消化液3 37度水浴消化1h。

　　7.消化完成后用移液器充分吹打100次左右，然后用含血清的培養基終止消化，過200目不銹鋼網篩后取濾懸液，轉入15ml離心管中，400g離心10分鐘，離心完成后棄去上清，沉淀用3ml的1×PBS吹打重懸后，400g離心5min離心完成后棄去上清，沉淀用2ml的原代角質細胞培養基吹打重懸后，轉入已經裝有2ml培養基的T-25培養瓶中，將培養瓶置于37℃的二氧化碳培養箱中培養。

　　8.視細胞貼壁情況48-72h后換液去除未貼壁的細胞，之后繼續培養，視細胞生長狀況和培養基顏色每2-3d換液一次;待細胞貼壁率達到80-90%后，進行常規傳代擴增操作(角質細胞對胰酶不太敏感，消化時間可能會增加到10-15分鐘，有時需要配合使用無菌細胞刮鏟進行傳代)。