外泌體整體服務
外泌體（Exosome）是一種由細胞分泌的膜性囊泡小體，其直徑通常為30-100nm，比其它的一些囊泡（凋亡小體）要小得多。外泌體廣泛存在于各種體液中，可攜帶蛋白質、脂類、核酸（miRNAs，ncRNAs）等多種生物功能大分子。新的研究表明，外泌體形成了一種特殊的細胞間信息傳遞系統，它不僅影響細胞的生理狀態，而且還與多種疾病的發生與發展密切相關。外泌體領域的研究已經在癌癥的診斷及治療等領域發揮重要作用，基于質譜的高通量蛋白質組學是研究外泌體不可或缺的一項技術手段。
外泌體具有磷脂雙分子膜結構，導致其沉降系數和蛋白質聚集體有著很大的不同。而且外泌體膜表面存在特異性膜蛋白如CD9和CD81，前者被證實和腫瘤遷移有關，后者與丙型肝炎病毒的侵染有關。而因為外泌體具有這些顯著的易分離的特點，我們可以通過密度梯度離心，親和層析等方法對外泌體進行分離和純化。
1. 外泌體提取-800元/樣本
超速離心是從生物體液或細胞上清分離外泌體的金標準方法。采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。目前在國內外普遍應用的經典技術手段。
一、技術簡介：
外泌體（Exosomes）是一種直徑在30-200 nm的微小囊泡，可由機體眾多類型細胞釋放，并廣泛分布于唾液、血漿、乳汁、尿液等體液當中。外泌體可攜帶多種蛋白質、mRNA、miRNA,參與細胞通訊、細胞遷移、血管新生和腫瘤細胞生長等過程。
目前外泌提取主要有超速離心、過濾離心、試劑盒提取等方法。其中超速離心分離得到外泌體，純度高，得率大，可滿足于后續不同實驗的需求。本公司具備貝克曼的超高速離心機，隨到隨分，效率高，質量有保證
二、服務流程：
培養上清樣本：
1. 培養液收集（干冰保存運輸）。
2. 低速離心去除細胞、碎片及雜質。
3. 超速離心獲得外泌體沉淀。
4. 外泌體純化。
5.BCA法檢測外泌體濃度。
6.提供實驗報告。
血清/血漿樣本：
1. 分離得到血漿/血清（血清血漿干冰保存運輸，全血抗凝冰袋運輸）。
2.低速離心去除碎片及雜質。
3. 超速離心獲得外泌體沉淀。
4. 外泌體純化。
5. BCA法檢測外泌體濃度。
6. 提供實驗報告。
三、結果形式：
1. 客戶提供：血清或血漿（3-5ml）;培養基（50-100ml），或委托我公司代為培養收集細胞上清
2.公司提供：基本實驗步驟、圖片、數據分析結果。
3.實驗周期：3個工作日
4.儀器設備：超高速離心機（品牌：BECKMAN 型號：Optima XPN-100）
2. 外泌體粒徑檢測-500元/樣本
一、技術簡介：
納米顆粒跟蹤分析（Nanoparticle TrackingAnalysis, NTA）是對每個顆粒的布朗運動進行追蹤和分析，結合Stockes-Einstein方程式計算出納米顆粒的流體力學直徑和濃度，檢測10nm–1000nm 范圍內的顆粒。NTA技術已被外泌體研究領域認可為外泌體表征手段之一；相較于其他表征方式，NTA技術的樣本處理更簡單、更能保證外泌體原始狀態、檢測速度更快。
二、服務流程：
1. 客戶提供外泌體（干冰運輸）
2.外泌體粒徑檢測。
3. 提供實驗報告。
三、結果形式：
1. 客戶提供：外泌體（30ul-50ul）
2.公司提供：基本實驗步驟、圖片、數據分析結果。
3.實驗周期：3個工作日
儀器設備：馬爾文納米顆粒跟蹤分析儀Nanosight NS300
3. 外泌體透射電鏡鑒定-1000元/樣本
一、透射電鏡檢測外泌體原理：
雙層囊膜結構（茶托狀）是外泌體重要標志之一，但普通光學顯微鏡難以觀察到此種亞顯微結構。而透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope, TEM) 分辨率可達0.1 -0.2 nm，可將被觀察物體放大至數百萬倍，是外泌體雙層囊膜超微結構觀測的經典方法。
二、服務流程：
1.外泌體戊二醛固定（冰袋運輸）。
2.外泌體電鏡制樣。
3.上機觀察。
4.提供實驗報告。
三、實驗流程：
1. 客戶提供：外泌體（30-50 μl）。
2. 公司提供：實驗步驟，實驗報告和原始圖片。
3. 實驗周期：2-3周。
4.儀器設備：透射電子顯微鏡 FEITecnai G2 Spirit
4.外泌體WB鑒定
外泌體（Exosome）主要檢測指標為CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等，針對外泌體的定性檢測，至少選擇2-3個指標就能滿足文章發表要求。本公司提供外泌體標記蛋白檢測和相關抗體
5. 外泌體熒光標記-3000元/樣本
1. 親脂性染料:PKH-67（green）/PKH-26（red）
染料可以穩定的與細胞膜脂質區結合并發出熒光，主要用于細胞體外標記、體外細胞增殖研究以及體內外的細胞失蹤研究。PKH67的體內熒光半衰期為10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更長的半衰期，標記在兔紅細胞上的PKH26半衰期長達100天以上。特別適用于體外增殖研究以及長期的體內細胞跟蹤研究。
2. 親脂性羰花青染料（carbocyaninedyes）:DiI/DiD/DiO/DiR
DiI, DiO, DiD, DiR是一系列親脂性的熒光染料，可以用來染細胞膜和其它脂溶性生物結構。這些環境敏感性熒光染料在進入細胞膜之前熒光非常弱，當與細胞膜結合后其熒光強度大大增強。且具有消光系數高、極性依賴性、激發態壽命短等特點。一旦進入細胞膜后，可在整個細胞膜上擴散，最佳濃度時可以使整個細胞膜染色。
6. 外泌體RNA測序
送樣要求：
1）血漿樣本采集：EDTA抗凝管采集患者血液，若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過4 h）；將采集到的血液在4℃下1500 g，離心20min，去除血液中的細胞；取上清，4℃下3000 g，離心15min，收集上清（血漿），-80℃保存。送樣量： 4mL
注意事項：1. 請勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放； 2. 請排除乙肝病毒，HIV等病毒感染樣本。
2）血清樣本采集：用促凝管采集患者血液，若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過4 h）；將采集到的血液在4℃下1500 g，離心20min，去除血液中的細胞；
取上清，收集上清（血清），-80℃保存。送樣量： 4 mL 注意事項：1. 請排除乙肝病毒，HIV等病毒感染樣本。
3）尿液樣本采集：采集前/中后段晨尿約60 mL，若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過8 h）；將采集到的尿液在4℃下（室溫亦可）離心2000 g，20 min，去除尿液中的細胞；-80℃保存。送樣量：60 mL。
注意事項：請務必囑咐患者，i)采集晨尿，或6 h以上未排尿亦可；ii)中段尿請務必去掉最初排出的50-80 mL尿液；iii）女性受試者，請于采尿前對外陰進行清洗。
4）胸水樣本采集臨床收集胸水后若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過8 h）；將收集到的胸水1000 g離心10 min，收集上清液；將得到的胸水上清3000 g離心10min，收集上清，-80℃保存。送樣量：30 mL
5）腹水樣本采集臨床收集腹水后若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過8 h）；將采集到的腹水在4℃下（室溫亦可）離心2000 g，20min，去除腹水中的殘渣；-80℃保存。送樣量：30 mL。
6）腦脊液樣本采集采集方式為腰椎穿刺，樣本一經分離，請務必立即置于冰上或4℃短暫保存（不得超過4 h），采樣時注意避免血液污染；樣本室溫下2000 g離心20min去除細胞及部分碎片，取上清，-80℃保存。送樣量：5 mL 注：請勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放。
7）膽汁樣本采集用無菌容器收集膽汁；將收集到的膽汁在4℃下，3000 g離心10 min去除細胞沉渣和碎片；收集膽汁上清液，4℃或者-20℃長期保存。送樣量：5 mL
8）細胞上清樣本采集
對于耐受無血清培養的細胞的處理流程：對于貼壁細胞匯合密度在70%以上，用PBS洗滌細胞2-3遍去除殘留牛血清，添加無血清培養基，繼續培養24小時。細胞上清先用200-300g離心10min，再用3000g離心10min，最后0.22um過膜或者10000g離心30min。儲存運輸：將處理好的細胞上清收集在無菌培養瓶，-80保存或者干冰運輸，體積需求細胞上清原液大于100ml .對于一些狀態良好的細胞上清，少至70ml，也可以得到較好的外泌體分離結果。
對于不耐受無血清培養的細胞的處理流程：對于貼壁細胞匯合密度在70%以上，用PBS洗滌細胞2-3遍去除殘留牛血清，添加含5%無外泌體血清的培養基，繼續培養24小時。細胞上清先用200-300g離心10min，再用3000g離心10min，最后0.22um過膜或者10000g離心30min。將處理好的細胞上清收集在無菌培養瓶，-80保存或者干冰運輸，體積需求細胞上清原液大于100ml.對于一些狀態良好的細胞上清，少至70ml，也可以得到較好的外泌體分離結果。送樣量：細胞上清原液建議大于100 mL。
